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人類白細胞抗原 B27檢測方法及意義

更新時間:2014-08-01   點擊次數:6697次

                    人類白細胞抗原 B27檢測方法及意義

HLA是組織細胞上受遺傳控制的個體特異性抗原,zui早是在白細胞和血小板上發現的,現在發現該抗原廣泛分布于皮膚、腎、脾、肺、腸和心等組織器官有核細胞的細胞膜上。第8次組織相容性會議確定HLA有92個,分屬于A、B、C、D和DR5個位點,分別稱為HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-D和HLA-DR。HLA-B位點有42個,B27為其中之一。現已證明HLA-B27陽性者比HLA-B27陰性者發生強直性脊柱炎的機會要大得多。

2 HLA B27檢測意義

臨床意義:強直性脊柱炎病人HLA-B27的陽性率為90%。瑞特綜合征的陽性率為80%。有報導說,HLA-B27陽性的正常人中大約有8%日后發展為強直性脊柱炎的可能。

3 本試劑盒采用檢測方法

本試劑盒采用TaqMan 的熒光PCR方法,結合序列特異性PCR(PCR-SSP)技術。從GenBank中選取已公布的所有HLA亞型,進行序列比對后設計一對特異性引物和一條特異性熒光探針,既提高了檢測靈敏度、準確性,又使檢測簡便快速,反應結束后直接分析判讀,無需電泳檢測。

4 試劑盒性能參數

便捷性:本試劑盒采用堿裂解法提取外周血DNA,操作過程方便快捷,從提取到結果判斷全程耗時小于90分鐘,適用于市面上的多款熒光PCR儀。

準確性:對檢測出150例陽性標本進行測序分析,準確性達到100%。

靈敏度:zui低檢測約為1000 Copies/ml,對DNA的要求濃度低,線性范圍1×103-1×109,重現性好。

特異性:與One Lamda HLA B27試劑進行比較,結果一致性達到99.4%(359/361)。

安全性:本試劑盒采用PCR-熒光探針技術,避免了PCR-SSP單一技術擴增后產物經凝膠電泳EB染色,避免了致癌物質接促及PCR產物污染等問題。

強直性脊柱炎B27檢測試劑盒(磁酶聯免疫法)

英文名稱:HLA-B27 Assay Kit

【包裝規格】

   48人份/

【簡 介】

    HLA-B27與強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)強相關。AS在我國的患病率為0.3%,其中90%-98%的患者出現HLA-B27陽性。因此,B27的檢測對排除AS的診斷有輔助作用并有助于早期發現B27抗原的存在,對于患者及早進行相應的干預措施具有指導意義。本試劑盒提供含有抗HLA-B27抗體的磁珠,特異性針對人白細胞抗原B27

【預期用途】

    本試劑盒主要用于檢測人全血中B27抗原是否存在,作為強直性脊柱炎的鑒別診斷。

【檢驗原理】

    本試劑盒應用磁珠分離法,在高品質磁珠上耦聯B27抗體,與全血中白細胞上的B27抗原反應,同時,加入HRP標記的抗體聯結至白細胞上。經洗滌后,磁珠上含有B27抗原的細胞和酶均被保留下來。加入底物液顯色,終止反應后在酶標儀450nm讀取吸光度值。

【主要組成成份】

本試劑盒包含以下組分:

  1. MICROPLAT -包被抗體的微孔板條

REF PC-01A

孔內包被HLA-B27磁珠的抗體,微孔板條6×8孔條,包裝于帶干燥劑的鋁箔袋中。

  1. ENZYMCONJ-酶結合物(REF PC-01B

HRP標記的抗細胞抗體,每瓶60µl

  1. ENZYMDIL-酶稀釋液(REF PC-01C

用于稀釋酶結合物,每瓶3ml

  1. WASHBUF 20×—濃縮洗液(REF FC-01D

含吐溫的磷酸緩沖液,每瓶10ml

  1. SUBSA -TMB底物液AREF PC-SUBSA 

每瓶3 ml

  1. SUBSA -TMB底物液BREF PC-SUBSB 

                         每瓶3 ml

  1. PC陽性對照品(REF PC-PC

每瓶300 ul

  1. PC陰性對照品(REF PC-NC

每瓶300 ul

  1. STOP終止液(REF PC-STOP

每瓶3 ml

10. 微孔板架          1

11.文件              說明書1

 

【儲存條件及有效期】

試劑盒儲存于2-8可保存至試劑盒上所標示的zui后有效期日。

未使用完的微孔板條應放回至有干燥劑的鋁箔袋中,將鋁箔袋折好并密封于塑料封口袋中,2-8下可保存8周。

洗液開封后在室溫下可保存8周。

【樣本采集和保存條件】

   EDTA-K3抗凝的全血樣本(靜脈采血),已打開過的、已污染的、已溶血的、已凝結的血液樣本可能引起不一致的測試結果,應避免使用。不能立即使用的樣本應靜置(豎立)保存于2-8ºC,不超過5天使用。

【額外需要的材料和設備】

1.  EDTA-K3抗凝管

2.  可調微量移液槍0.5-10ul20-200ul,八道加樣槍和槍頭

3.  磁板(可重復使用)

4.  振蕩器

5.  計時器

6.  能夠測量波長為450nm的酶標儀

7.  去離子水

8.  真空負壓泵(可選項,洗板時使用,有助于實現洗板*)

【檢驗方法】
試劑準備

  1. 取出所有試劑和待測樣本,平衡至室溫。
  2. 對樣本、陽性對照品、陰性對照品進行編號并記錄。
  3. 取出所需微孔板條,其余放回密封袋中封好, 2-8保存。
  4. 將酶結合物60 ul加入至酶稀釋液中,確保充分混勻。混勻后的溶液稱為酶結合物溶液。
  5. 用去離子水或蒸餾水稀釋濃縮洗液(201)。室溫下保存。

檢測步驟

  1.   加入酶結合物溶液50ul至每一微孔中,輕拍板架,使磁珠分散。
  2.   將抗凝管(EDTA-K3)輕輕顛倒混勻數次, 按記錄單中的安排分別加入樣本、陽性對照品、陰性對照品各50ul。輕拍板架數次,使磁珠和樣本充分混勻。
  3.   將板架放置于振蕩器上(200/分鐘),室溫下反應10-15分鐘。
  4.   加入洗液250ul后,將板架置于磁板上靜置2
     
    分鐘(一定要等散開的磁珠被磁板吸附到底
      部), 再甩板或采用真空負壓泵吸取液體。
      注意:采用真空負壓泵吸出洗液后,把板架從
      磁板上取下,用手輕叩板架邊緣數次,看到磁
      珠散開后,再加入洗液,每次清洗皆如此重復。
  5.   每孔再加入洗液250ul。利用加入時的沖擊力使磁珠分散,如發現有聚團,輕拍板架使磁珠分散。將板架放于磁板上,靜置2分鐘。再甩板或采用真空負壓泵吸取液體。
  6.   重復5步驟共4次。
  7.   每孔加入底物A液、B液各50uL。輕拍板架使之充分混合后,室溫下避光放置15分鐘。

注:底物液易受污染,僅移取檢測時所需的量,未用完的底物液須丟棄。

  1.   每孔加入終止液50uL
  2.   將板架置于磁板上,使磁珠吸于微孔側壁。
  3.   輕輕取下板架,在30分鐘內將板架置于波長
      450nm下,讀取吸光度值(OD)。
     

【參考值(參考范圍)】
每個實驗室應建立自己的參考范圍。

  1. 陽性:樣本 OD值≥0.8
  2. 陰性:樣本 OD值≤0.4

【檢驗結果的解釋】

OD值在0.4-0.8,請重復實驗,必要時用其它方法驗證。

【產品性能指標】

批內差異:≤15%

批間差異:≤15

準確性:檢測陰性和陽性對照吸光度,測試結果應在其允許范圍內。

【檢驗方法的局限性】

診斷結果應結合患者的臨床癥狀和醫師其他的實驗室的檢查進行分析。

【注意事項】

  1. 本試劑盒僅供人體外診斷,不得內用,須嚴格按照說明書進行操作。因未按說明書要求操作引起的損失及責任公司不予承擔。
  2. 本試劑盒包含人和/或動物來源的材料。盒中試劑應作為有潛在傳染性因子來處理儲藏操作和處理試劑應有適當的預防措施和良好的實驗室操作。試劑的處理應符合當地法令。
  3. 終止液對眼睛和皮膚有刺激。如不慎與眼接觸, 立刻以大量的水清洗,并尋求專業醫師幫助。操作本試劑盒時請穿戴適當的防護服和手套。
    1. 底物對皮膚接觸或吞咽都是有害的穿戴

適當的防護服和手套。